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摘要： 　　　　(1)利用泉源于C57BL/6小鼠的树突状细胞系DC2.4,探究连合应用人TLR8冲动剂CL075和TLR7/8调治剂Poly dT后,小鼠TLR8可否...

　　(1)利用 泉源 于C57BL/6小鼠的树突状细胞系DC2.4,探究 连合 应用人TLR8冲动 剂CL075和TLR7/8调治 剂Poly dT后,小鼠TLR8可否 被激活以及TLR8激活以后对TLR8以及相干 细胞因子如IL-10、IL-12和TNF-a表达的影响；(2)创建 小鼠肿瘤模 型(Lewis肺癌模子 ),进一步探究 TLR8激活对肿瘤生长的影响及其抗肿瘤免疫应答的调治 机制；(3)利用 临床肿瘤标本(人宫颈癌构造 )以及相干 细胞 系(人宫颈癌Hela细胞),观察TLR8在人体癌构造 的表达以及TLR8激活以后对肿瘤细胞增殖和生存的影响,以便为以TLR8为靶点的肿瘤免疫治疗提 供实行 和理论依据。方法：(1)在体外实行 中,DC2.4细胞用含有10%小牛血清的RPMI1640作育 液通例 作育 ,光学显微镜下观察其经PBS、 CL075、Poly dT以及CL075与Poly dT联实用 药刺激后的形态学变革 ；RT-PCR或qPT-PCR、免疫荧光法以及Western-blot检测TLR8在DC2.4的表达与分 布；qPT-PCR、ELISA法检测DC2.4经上述药物刺激以后相干 细胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的表达；MTT比色法检测TLR8激 动剂激活受体后对DC2.4抗原提呈功能的影响；qRT-PCR与Western-blot检测经药物刺激后对TLR8受体表达的影响。(2)在体内实行 中,取纯系C57BL/6小鼠,22-24克,雄性,随机分成三组,每组10只。小鼠右侧腹壁消毒后,皮下注射Lewis肺癌细胞3.0×106个细胞 /只,创建 Lewis肺癌小鼠模子 。Lewis细胞接种于小鼠当天即开始给药,PBS、CL075和Poly dT均经腹腔注射给药。CL0750.2μg+Poly dT5μg(低剂量组)每天 给药一次,PBS组、CL0752μg+Poly dT50μg(高剂量组)每两天给药一次。接种Lewis肺癌细胞第1天后,隔天用电子天平丈量 小鼠体重一次,7天后,用脱毛剂对各实行 组小鼠举行 脱毛, 观察肿瘤的生长环境 。肉眼观察并按摸皮下结节,用游标卡尺隔天丈量 1次肿瘤结节的长径a及短径b,单位 mm,根据公式V=1/2×axb2估算肿瘤体积。 给药后第二十一天,在麻醉状态下断颈正法 小鼠,取出肿瘤构造 ,用电子天平称重,盘算 每组均匀 瘤重,qRT-PCR检测小鼠脾脏及引流淋巴结中TLR8、 IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-βFoxp3的表达,FCM检测小鼠脾脏及引流淋巴结中CDllc+细胞TLR8的表达,FCM检测小鼠脾 脏及引流淋巴结中CD3+CD8-IFN-γ+T细胞、CD3+CD8+IFNγ+T细胞以及CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例。(3)临床标 天职 析采取 病人宫颈癌构造 ,并连合 宫颈癌细胞系举行 相干 验证工作。人宫颈癌细胞系Hela细胞用含有10%小牛血清的DMEM作育 液作育 。采取 RT- PCR/qRT-PCR、免疫荧光法检测Hela细胞TLR8的表达与分布,流式细胞术、MTT比色法检测TLR8冲动 剂CL075对宫颈癌细胞周期和细 胞凋亡的影响,qRT-PCR检测COX-2.Bcl-2VEGF在经CL075刺激的人宫颈癌细胞株中的表达。取人宫颈癌构造 及康健 对照组样 本,qRT-PCR检钡TLR7、TLR8与Bcl-2或VEGF的表达并分析其相干 性,末了 综合分析TLR8在人宫颈癌细胞的表达及TLR8冲动 剂对肿 瘤增殖和存活的影响。结果 :(1)光学显微镜下观察发现,DC2.4细胞呈梭形、星状和多角形,与成熟的树突状细胞相比,树状突起不长,个体较小,细胞透 亮,细胞核清楚 。分别用PBS、CL075、Poly dT以及CL075+Poly dT刺激24h后,继承 在光镜下观察发现：经CL075+Poly dT联实用 药刺激的DC2.4细胞树突增多且伸长,而未刺激、单用CL075或Poly dT刺激的DC2.4细胞树突较短且少。RT-PCR/qPT-PCR.免疫荧光法以及Western-blot分别从mRNA程度 和卵白 程度 证明 DC2.4细胞表达TLR8,而且TLR8重要 分布于细胞浆内。通过qRT-PCR口ELISA检测发现,与对照组相比,无论是mRNA程度 还是 卵白 水 平,CL075+Poly dT联实用 药组细胞分泌TNF-α和IL-12的水均匀 明显 增长 (*p0.05),而IL-10的分泌程度 明显 低落 (*p0.05).尽 管CL075处理 惩罚 组细胞TNF-α mRNA、TNF-α卵白 和IL-12mRNA程度 也略有增长 ,但与对照组相比均无统计学意义,而Poly dT处理 惩罚 组DC2.4细胞TNF-α、IL-12和IL-10的mRNA和卵白 表达量均无变革 。肴杂 淋巴细胞反应实行 发现：与对照组相比,经 CL075+Poly dT刺激72h后的DC2.4可促进T淋巴细胞增殖(与对照组相比,**p0.01),且T细胞与DC的比例为5：1时刺激作用更显着 。进一步的 研究发现,CL075+Poly dT连合 处理 惩罚 组的DC2.4细胞中TLR8mRNA和TLR8卵白 的表达量显着 高于阴性对照组(*p0.05),CL075或Poly dT单独处理 惩罚 组DC2.4细胞TLR8的表达量与阴性对照组相比无显着 变革 。(2)小鼠体内实行 结果 发现,腹腔注射CL075与Poly dT有效 克制 了肿瘤的生长。CL075+Poly dT高剂量组小鼠的肿瘤体积与肿瘤重量显着 小于PBS对照组(*P0.05,n=10)。与PBS组相比,CL0752μg+Ply dT50μg(高剂量)组、CL0750.2μg+Poly dT5μg(低剂量)组小鼠体重无显着 差别 。qRT-PCR检测发现,高剂量CL075+Poly dT可以明显 增长 荷瘤小鼠脾脏和引流淋巴结IL-12mRNA的表达,引流淋巴结中TNF-α mRNA的表达也明显 增长 ,而克制 性细胞因子IL-10.TGF-βFoxp3的mRNA在脾脏和引流淋巴结中的表达量则显着 低落 (与对照组相 比,*P0.05或**P0.01,n=4)。流式细胞术的实行 结果 进一步证明 ,高剂量CL075+Poly dT可以促进脾脏和引流淋巴结中CD3+CD8-IFN-γ+T细胞和CD3+CD8+IFNγ+T细胞的增殖,而显着 克制 CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖(与对照组相比,*P0.05或**P0.01,n=6),证明 CL075与PolydT联 合应用一方面通过刺激荷瘤小鼠分泌IL-12、TNF-α等细胞因子,诱导Thl型应答和CD8+细胞毒作用,从而加强 小鼠的抗肿瘤免疫应答；另一方 面,CL075与Poly dT实用 ,可通过镌汰 荷瘤小鼠体内克制 性细胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的表达,和克制 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖 而负向调控肿瘤免疫耐受,从而有效 加强 了荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答,延缓了肿瘤的发展进程 。本研究同时还发现,与高剂量CL075+Poly dT目比,低剂量CL075+PolydT克制 肿瘤生长和加强 抗肿瘤免疫的作用固然 不如高剂量显着 ,但仍有肯定 的作用。而且,低剂量CL075+Poly dT可以显着 诱导脾脏和引流淋巴结中CDllc+细胞TLR8的表达,这和我们在体外实行 中发现的CL075与Poly dT实用 诱导DC2.4细胞TLR8表达的实行 结果 相同等 。(3)我们采取 RT-PCR和qRT-PCR检测了包罗 Hela细胞在内的十三种人类肿瘤细胞 系,包罗 95D.HepG2.NICH446.U266.SGC.HCT-8. BGC.SW620.A549.HT1080.SKOV.3和U937等细胞TLR8的表达,结果 发现,SKOV-3.U937和Hela表达高程度 的 TLR8mRNA,胃癌SGC,HCT8,BGC,SW620,A549和HT1080表达低程度 TLR8;而在95D.HepG2.NICH446或 U266细胞没有检测到TLR8mRNA.TLR8mRNA在宫颈癌细胞系中的表达程度 明显 高于其他细胞系,免疫荧光染色表明Hela细胞表达TLR8蛋 白,而且TLR8分布于细胞浆内。用差别 浓度的TLR8冲动 剂CL075处理 惩罚 HeLa细胞48小时后,流式细胞术检测发现G2/M+S期细胞的百分比增 加,提示细胞增殖增长 ,这一结果 被MTT法进一步证明 。差别 于顺铂,CL075没有诱导Hela细胞凋亡。CL075(1μg/ml)处理 惩罚 24小时 后,Hela细胞中COX-2, BCL-2和VEGF mRNA程度 明显 增长 并在48小时到达 峰值。定量RT-PCR结果 表明,与没有癌症患者的宫颈构造 相比,宫颈癌患者构造 样本中TLR7和TLR8 的]mRNA程度 增高。与此相反,TLR9在癌症患者和对照组构造 样本中的表达没有显着 差别 ,别的 ,Bcl-2和VEGF在宫颈癌患者的癌构造 中的表达水 平也明显 增长 。采取 Spearman分析,我们发现宫颈癌样本中TLR8口Bcl-2或VEGF的表达程度 之间存在正相干 ,而TLR7和Bcl-2或、 /EGF mRNA表达程度 的变革 并无显着 相干 性。结论：(1)人TLR8冲动 剂CL075与TLR7/8调治 剂Poly dT连合 应用可以有效 激活小鼠TLR8,而且小鼠TLR8活化以后产生与人TLR8相似的效应,如诱导髓系树突状细胞分泌TNF-α、IL-12,镌汰 IL-10的分泌,有利于诱导Thl型免疫,加强 DC的抗原提呈功能。因此,可以将[CL075+Poly dT]作为工具药,以小鼠为模子 体表里 研究TLR8的功能。(2)TLR8可以作为肿瘤免疫治疗的紧张 靶点。在体外,TLR8冲动 剂诱导DC2.4分泌 TNF-α和IL-12,加强 DC2.4的抗原提呈功能,而且这些作用大概 和DC2.4细胞TLR8的上调有关；在体内,TLR8冲动 剂促进荷瘤小鼠 Th1型免疫应答炎性细胞因子(TNF-α和IL-12)的产生、镌汰 包罗 IL-10, TGF-β和Foxp3的免疫克制 因子的分泌,刺激CD3+CD8-IFN-γ+T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的增殖,克制 CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖,从而加强 Lewis肺癌模子 小鼠的抗肿瘤免疫应答,延缓肿瘤的发展进程 ,而且 小剂量 CL075+PolydT上调树突状细胞TLR8的表达以加强 其对冲动 剂的反应。这些结果 表明,TLR8的活化以及DC等免疫细胞TLR8的上调有利于增 强抗肿瘤免疫应答。(3)然而,差别 的肿瘤以及发生于差别 个体的同一种肿瘤具有显着 的非均一性,因此TLR8及其冲动 剂的抗肿瘤作用必要 全面评估,这在肿 瘤的个体化治疗中具有非常 紧张 的意义。人宫颈癌构造 及宫颈癌细胞系高表达TLR8,这些肿瘤细胞也利用 TLR8信号来创造有利于生长和生存的条件,如上调 Bcl-2和VEGF表达。这表明TLR8信号在肿瘤治疗中大概 是一把双刃剑。TLR8及其冲动 剂在差别 范例 的肿瘤中大概 发挥差别 的作用。